神经递质是生物学上重要的内源性化学信使，广泛存在于哺乳动物的中枢神经系统、脑组织和体液中，其含量测定对神经运动学、运动生理学、病理学、临床医学、疾病诊断等都有重要意义[1]。脑内的神经递质一般分为单胺类、肽类、氨基酸等几类。神经递质含量的异常与焦虑症、抑郁症、阿尔兹海默病等脑疾病密切相关。ICE团队利用液相色谱质联用法对四种神经递质（Glu、GABA、ACh、DA）检测进行方法学验证，并开展了两种疾病动物模型脑内神经递质的含量测试[2]。神经递质含量的检测对新药研发的治疗效果及作用机理研究具有重要的研究意义。
使用超高效液相色谱（UPLC）仪器根据不同化合物的化学性质进行方法建立，对化合物的线性、准确度、精密度进行数据收集，使用Waters Corporation的Empower软件测量神经递质（Glu、GABA、ACh、DA）的峰面积。使用Microsoft Excel 2010版进行数据处理，包括算术平均值（平均值）和标准差、精密度（%RSD）和准确度（%RE）。准确度计算公式：%RE=100×（实测浓度均值−标识浓度）/标识浓度。精密度验收标准%RSD≤±10%，准确度验收标准%RE≤±15%。组织测定浓度（μg/mg）=检测浓度*稀释倍数/组织重量，组织测定浓度（μg/g）=检测浓度*稀释倍数*1000/组织重量。使用GraphPad prism8对生物样本检测的神经递质含量进行统计分析。
1.液相条件
2.标曲制备及结果
取一定量的Glu、GABA、ACh、DA标准品，用0.2%的甲酸水溶液分别将其溶解成1.00 mg/mL的母液，然后稀释成0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 μg/mL的浓度点，进样分析并拟合线性。其结果如下：
3.精密度及准确度样品及结果
称取一定量的Glu、GABA、ACh、DA标准品，用0.2%的甲酸水溶液分别将其溶解成1.00 mg/mL的母液，并稀释成0.40、1.60、4.80 μg/mL的浓度点，进样并数据处理，具体分析结果如下：
脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌的表面抗原物质，可作为一种强有效的免疫刺激因子激活小胶质细胞，促进炎症反应发生[3]。本次实验通过对小鼠腹腔注射LPS (1mg/kg)来制备动物神经炎症模型。6-羟基多巴胺(6-OHDA)是一种类似于去甲肾上腺素的化学制剂，具有较强的神经毒性，在大鼠脑内局部注射后能够高选择地引起交感神经肾上腺素能神经末梢的急性溃变，并逆行性造成神经元不可逆的损伤[4]。6-羟基多巴胺的作用机制是在脑组织内竞争性抑制多巴胺(DA) [5]，并对线粒体呼吸链产生强有力的阻滞作用，导致局部抗氧化物含量及三磷腺苷(ATP)的产生明显减少[6]，引起多巴胺能神经元(nigral dopaminergic neuron，NDN)的特异性凋亡、坏死[7]。1) 将动物置于冰上取材；
2) 称重后加入组织裂解液；
3) 置于1.5 mL离心管中充分匀浆；
4) 超声破碎两次；
5) 14000 rpm，离心15 min；
6) 取上清于另一离心管；7) 重新离心一次，再次取上清液，-80℃保存；
8) 取样品冰上溶化，离心后使用0.2 μm滤膜过滤；
9) 使用UPLC检测。2.2.1 LPS诱导的神经炎症模型的神经递质检测
Fig.1 利用UPLC-MS检测LPS诱导的神经炎症模型组与对照组小鼠的海马组织中神经递质含量，与对照组相比，模型组GABA、ACh、Glu含量明显降低。2.2.2 6-羟基多巴胺制备帕金森病动物模型的神经递质检测
Fig.2 利用UPLC-MS检测6-羟基多巴胺制备帕金森病动物模型小鼠的纹状体中神经递质含量，与对照组相比，模型组多巴胺（DA）含量明显降低。对于神经递质检测，与传统的HPLC-ECD检测相比，UPLC-MS或UPLC-MS/MS具有灵敏度高，特异性强，检测时间短的优势。在四种神经递质分析方法验证中，其中线性、系统适用性、精密度和准确度均满足生物样本检测要求；神经系统疾病模型中的神经递质含量检测结果显示:（1）LPS诱导的神经炎症模型中神经递质GABA、ACh、Glu含量与对照组相比明显降低（2）纹状体组织中神经递质多巴胺（DA）含量显著降低可作为6-羟基多巴胺脑内注射制备帕金森病动物模型成功的一项检测指标。ICE团队后续会制备更多的神经系统疾病关联的动物模型和推出更多的神经递质检测方法，来支持客户的神经系统类疾病相关的申报与非申报项目。
【参考文献】
[1]潘凌云，王雨，刘新华，贾益群等UPLC-MS / MS 同时测定大鼠脑微透析样品中11个神经递质含量 中国实验方剂学杂志，2019，3242-3250．[2]张蕾，孔令提，孙兰，等． LC-MS / MS 同时测定小鼠脑组织中 7 种神经递质含量［J］． 中国实验方剂学杂志，2013，19( 20) : 132．[3]基因组学与应用生物学，2017 年，第 36 卷，第 4 期，第 1361-1367 页Genomics and Applied Biology, 2017, Vol.36, No.4, 1361-1367[4]王玉玲，高华，杨新玲. 6-羟基多巴胺单侧两点注射法构建的帕金森病模型鼠[J].中国组织工程研究，2013，17(46):8030-8035.[5]Banuelos, C., et al., 2014. Prefrontal cortical GABAergic dysfunction contributes to age-related working memory impairment. J. Neurosci. 34, 3457–3466. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.5192-13.2014.[6]Bernabo, N., Barboni, B., Maccarrone, M., 2013. Systems biology analysis of the en-docannabinoid system reveals a scale-free network with distinct roles for anandamide and 2-arachidonoylglycerol. OMICS 17, 646–654. https://doi.org/10.1089/omi.2013.0071.[7]Bovingdon, M.E., Webster, R.A., 1994. Derivatization reactions for neurotransmitters andtheir automation. J. Chromatogr. B, Biomed. Appl. 659, 157–183.
