【摘要】　病毒清除验证是生物制品病毒安全性的重要保障之一。 目前，在临床试验阶段或申报上市阶段采用工艺平台作为病毒清除能力的验证策略已被ICH Q5A（R2）接受。 病毒清除工艺平台验证技术，可以允许开发者在基于科学与风险的前提下适当减少临床前药物在病毒清除方面的验证研究，为申请人提供开发和申报过程中的时间和成本优势。 但与此同时，如何建立和应用工艺平台，对申请人的工艺理解和生产经验提出了更高的要求和挑战。本文将围绕病毒清除工艺平台的前期风险评估、建立方法、应用等关键阶段，结合相应的案例分析，以期为该技术的开发和评价提供引导和实用参考。

【关键词】　病毒清除；工艺平台验证技术；多因素正交分析法；案例法

［中图分类号］ R95　　［文献标志码］ Ａ　　

［文章编号］ 1003－3734(2025)06 – 0602 - 06

生物制品的病毒安全性是产品全生命周期的药学关注重点，而病毒清除验证是确保生物制品病毒安全性的重要技术手段之一，也是生物制品生产工艺中的关键环节。 以往，申请人一般采用开展拟申报产品的特异性验证，以证明其特定工艺步骤对潜在病毒清除能力的稳健性。然而，随着对病毒清除相关工艺步骤理解的不断深化，采用病毒清除工艺平台验证进行病毒安全性评估逐步获得认可，也有越来越多的国家或地区开始接受以平台验证的形式进行相关申报。 在此背景下，为规范和指导病毒清除工艺平台验证技术应用，国家药品监督管理局药品审评中心于2024年１月发布了《治疗用重组生物技术产品病毒清除工艺平台验证技术指导原则（试行）》[1]（以下简称为指导原则）。 本文旨在基于该指导原则的监管考量和框架，对临床试验申请阶段工艺平台的建立进行案例解析，以期为业界建立工艺平台提出科学建议。

病毒清除工艺平台验证，系指在所包括的各单元操作均在一组广泛的因素集内具有稳健的病毒清除能力。 当满足特定和严格的工艺和产品标准时，允许相似的产品和工艺在相似的工艺步骤中应用模型病毒清除的性能。 工艺平台可以由1个或多个工艺模块组成，目前主要接受采用溶剂/去污剂灭活、低pH灭活和病毒截留过滤步骤建立工艺模块。本文将结合典型案例解析，围绕工艺平台/模块建立的前期风险评估、建立方法和应用进行阐述。

1  工艺平台/模块建立的前期风险评估

在准备建立工艺平台/模块前，建议研发者对影响病毒清除效果的因素进行全面的了解和风险评估。病毒清除验证的代表性主要由以下因素组成：生产用细胞基质、指示病毒、验证用样品和工艺参数。因此，工艺模块的建立应围绕以上因素进行明确或开展相关研究，特别是对于工艺参数因素，由于其内含种类较多且在不同产品间变异性较强，是工艺模块设计空间探索研究的重点。

生产用细胞基质方面，指导原则中已进行明确，即采用来源于相同生产用细胞基质产品的验证数据方可组合为同一数据集用于支持工艺模块的建立。需要说明的是，以目前广泛使用的CHO细胞为例，其亚型视为同一细胞基质，而研发者额外对宿主细胞进行基因修饰则不可视为同一细胞基质。基因修饰操作中潜在的脱靶效应可能对宿主细胞的基因组进行非预期的编辑[2]，其生产的产品可能会呈现不同的杂质种类、内源性病毒载量水平，以上差异会影响特定步骤对病毒的清除效率。 此外，如采用病毒载体介导基因修饰，则可能影响指示病毒的代表性；指示病毒方面，采用相同指示病毒的验证研究方可纳入同一工艺模块的验证数据集合。文献报道或业界经验均显示，即使参数相同的清除步骤对于不同指示病毒（即使其理化性质相似）的清除能力仍可能存在差异[3]；产品（工艺中间体）方面，特定步骤中间体的部分质量属性可能会对该步骤的病毒清除能力产生不良影响，建议申请人关注低pH灭活步骤中的蛋白质浓度、病毒截留过滤步骤中可能影响样品黏度或微粒形成的潜在因素[4]和S/D灭活步骤的产品聚集体或颗粒状物质等，并在工艺模块建立和应用过程中对以上质量属性进行表征和代表性评估。

工艺参数方面，模块化工艺验证研究中，工艺参数类型的选择是整体研究的关键。 纳入工艺参数类型的数量与验证工作量和工艺模块对其他类似产品的适用范围成正比，建议研发者根据计划应用平台验证的多个相似产品的工艺变异性，合理拟定验证参数类型，使验证模型与实际应用相协调。以低pH灭活和病毒截留过滤步骤为例，结合ICH Q5A和指导原则，建议关注的工艺参数见表1。

表1 建议关注的低pH灭活和病毒截留过滤步骤工艺参数类型

a: 工艺中断是指在除病毒过滤过程中，跨膜压差降至0后再恢复至目标值并完成过滤，该情况有可能导致病毒穿透[5]。由于发生工艺中断的原因可能是预期内（中间体分批过滤）或非预期（如停电）的，且并非存在于多数案例中，建议在正交法建立工艺模块研究中对工艺中断进行研究

建议研发者依据先验知识、申报产品/工艺特点综合评估需纳入验证研究的工艺参数。未纳入的，建议在申报资料中明确具体参数，应采用指导原则中的推荐条件或在各组合条件下保持一致，后续计划采用该数据包的产品所采用的实际参数也应在推荐或验证的范围内。

2  工艺平台/模块的建立方法

单个工艺模块的建立可以采用2种方法：开展病毒清除工艺设计空间验证研究的多因素正交分析法或对既往产品的病毒清除数据进行回顾性分析的案例法。 本文将以低pH灭活和病毒截留过滤步骤为例，对如何使用多因素正交分析法和案例法建立工艺模块进行进一步阐述。

2.1 多因素正交分析法　 多因素正交分析法是一种科学的验证策略，通过系统地分析并设置多个工艺参数，形成特定病毒清除步骤的工艺参数设计空间，再通过括号法或矩阵法对代表性的工艺参数组合进行工艺表征和验证，确保特定步骤病毒清除能力的稳健性，最终将来自该方法研究的模块化病毒清除数据应用于其他项目。

首先，应分析并设计对工艺模块具有代表性的工艺参数组合。以括号法为例，将多个重要工艺参数的上限和下限进行合理组合，形成一组可以代表该模块设计空间的检测集合。值得注意的是，每增加1种工艺参数至正交试验中，都可能意味着组合数量成倍增长。事实上，根据作用机制或实践经验，部分单一因素对于病毒清除能力的影响比较明确且稳健，如低pH灭活步骤中的pH值、孵育温度和孵育时间等[6]，因此笔者建议该类参数可不采用括号法，而是于各组合中直接采用“最差情况”作为固定参数，以精简研究。

正交试验设计完成后，应对各组合条件进行病毒清除验证，该部分的要求与各相关法规文件和指导原则基本一致，每个组合需进行2次运行，采用原理相同的检定方法。最后得到各组合条件下对指示病毒的病毒滴度对数下降值(log reduction value, LRV)，选择所有结果中的最低LRV作为该工艺模块应用时声明的LRV，并以此LRV作为有效步骤认定和安全因子范围计算的依据。

举例如下：低pH灭活步骤中，采用pH=3.60、孵育温度15℃、孵育时间60min作为固定条件，正交组合设计和检测结果见表2。

表2 正交法设计低pH灭活步骤参数组合示例

a: 以检测到的最低LRV：5.23，作为该工艺模块声明的LRV

病毒截留过滤步骤中，采用同品牌同型号滤膜、产品中间体的体积通量为600L·（m²）^-1、冲洗过滤器用缓冲液的体积通量为100L·（m²）^-1、工艺中断1次作为固定条件，正交组合设计和检测结果见表3。

表3 正交法设计病毒截留过滤步骤参数组合示例

ａ：以检测到的最低LRV：5.05，作为该工艺模块声明的LRV

检测完成后，可根据正交试验覆盖的工艺参数范围建立工艺模块。 以上文中的例子建立的工艺模块见表4。

表4 正交法建立工艺模块示例

2.2 案例法　 案例法要求申请人具有多个相似产品的病毒清除验证研究经验，对既往数据进行回顾性地汇总和分析，此处同样以低pH灭活和病毒截留过滤步骤为例进行阐述。

低pH灭活：所有项目均为IgG1亚型并采用60min的孵育时间（见表5）。

表5 案例法设计低pH灭活步骤参数组合示例

a: 以检测到的最低LRV: 6.17，作为该工艺模块声明的LRV

病毒截留过滤：所有项目均为IgG1亚型并采用相同型号的滤膜（见表６）。 结合检测到的最低LRV所对应的工艺参数组合以及指导原则中推荐的工艺参数范围，拟定工艺模块的具体参数（见表7）。

表6 案例法设计病毒截留过滤步骤参数组合示例

ａ：以检测到的最低LRV: 4.89，作为该工艺模块声明的LRV

表7　案例法建立工艺模块示例

此处需注意，对于病毒截留过滤中的跨膜压力参数，由于不同滤膜品牌跨膜压力的最差条件不同（低/高压有泄漏风险），因此采用案例法建立的工艺模块中，跨膜压力的参数范围拟定建议结合供应商提供或研发者自行开展的相关验证研究结果合理拟定，并于沟通交流或申报资料中提供相关依据。

此外，S/D灭活目前也可被接受用于建立工艺模块，本文中虽未对该步骤进行举例分析，但工艺模块建立的整体设计思路与低pH灭活步骤基本相似。S/D灭活模块额外需要注意的问题是，由于样品中可能存在聚集或颗粒状物质并将病毒包裹其中，导致S/D试剂无法接触到病毒，进而对该步骤的灭活能力产生不利影响[7]。因此在S/D灭活工艺模块的建立和应用中，均要求对待灭活样品进行一次0.2µm过滤预处理，以规避上述风险。其余参数方面，推荐的S/D灭活条件可参考指导原则。

3  工艺模块的应用

拟申报产品在进行平台验证时，特定步骤的所有工艺参数必须被相应工艺模块内经验证的工艺参数范围覆盖，方可应用平台验证。申报资料中应列表明确拟申报产品的工艺参数控制范围和代表性批次的实际工艺参数，并与工艺模块参数进行对比，全面评估工艺模块对拟申报产品的代表性或适用性。列表举例见表8。

表8 工艺模块应用示例

需要明确的是，无论病毒截留过滤工艺模块建立的结果如何，应用之前，要求采用细小病毒作为指示病毒，进行一次针对拟申报产品的代表性确认验证研究。

４  讨论

展望该技术的未来发展，从工艺平台验证技术适用范围的角度来看，除目前主要被接受的以灭活或过滤为清除机制的工艺模块外，相信随着行业对病毒清除工艺理解的不断加深和平台验证申报/审评经验的逐渐丰富，以基于电荷差产生的静电吸附作用或分子间特异性相互结合为清除机制的层析步骤也有望被用于建立工艺模块。采用层析步骤建立工艺模块，其建立方法基本遵循上文论述的前期风险评估、正交法/案例法研究的思路。以被广泛地认为是有效病毒清除步骤的阴离子层析为例，该步骤清除病毒的原理为利用目的蛋白与病毒的等电点差异以实现两者的分离。基于该作用机制，对于既定的层析介质，可以通过调节上样pH和电导率改变样品的表面电荷，使阴离子层析以流穿和结合/洗脱等工作模式运行。 由于在不同的工作模式下，部分工艺参数的“最差情况”可能完全不同[8]，建议采用同一工作模式的组合/案例建立工艺模块。以多因素正交分析法建立流穿模式阴离子层析工艺模块为例，建议考虑固定其他参数（如保留时间、载量、层析介质型号、目的蛋白等电点）为最差情况（如有此种情况），对上样pH与上样电导率进行正交的设计空间探索，关注不同组合条件下对指示病毒的LRV，并通过检测目的蛋白流穿/结合比例以表征特定条件下的工作模式。另外，不同于清除能力更加稳健的低pH灭活和病毒截留过滤步骤，对于阴离子层析而言，由于高/低分子量物质、宿主细胞残留蛋白/DNA均带有表面电荷，其可以与病毒竞争性结合层析介质[9]，进而影响病毒清除能力，因此该步骤上样样品中产品/工艺相关杂质的水平不是在某些条件下可以被忽略的影响因素。基于以上原因，无论采用多因素正交分析法或案例法建立工艺模块，均建议结合验证数据评估上样样品的产品/工艺相关杂质残留水平对病毒清除能力的影响，必要时可将其作为考察因素纳入研究，并依据验证结果将上述杂质水平纳入工艺模块。后续计划应用该模块的产品，其中间体的杂质水平应在经验证的范围内。对于多因素正交分析法，可以额外考虑对验证用样品进行杂质加标，以拓宽工艺模块的适用范围。

5  结语

由于病毒清除工艺平台验证所带来的时间和成本优势，目前已有多家国内外企业在国内新药临床试验申请前（pre-IND）/新药临床试验审批（IND）阶段以工艺平台技术支持拟申报产品工艺中相关步骤病毒清除性能的评估与验证。本文希望通过对工艺平台建立与应用的详细阐述与实例分析，帮助申请人更深入地理解该技术的研发策略和监管要求，引导申请人对自身工艺进行全面、深入的表征与验证或对先验知识进行科学汇总，在保证申报产品病毒安全性的前提下更好地平衡使用工艺平台进行申报的获益与风险，为药品临床试验和申报上市阶段的病毒安全性控制提供更加全面和灵活的验证策略。

【参考文献】

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