引言

提高药物特异性、安全性和效力，同时最小化毒性，是开发新型治疗药物的核心目标。寡核苷酸是一类能够调节多种生物功能的新型治疗药物，正迅速发展。寡核苷酸通过沉默、激活、调节、编辑和替换来调节基因表达，特别是基于mRNA的基因表达调控。寡核苷酸易于合成、特异性强、靶点范围广且毒性低，因此在治疗遗传性疾病和神经退行性疾病方面前景广阔。尽管在提高寡核苷酸安全性和有效性方面取得了重大进展，但将寡核苷酸递送至肝脏以外的部位仍具挑战性。此外，提高寡核苷酸通过细胞内化的摄取效率是当前研究的主要焦点。

抗体-寡核苷酸偶联药物（AOC）是一类由抗体、连接子和寡核苷酸组成的新型治疗药物。AOCs结合了抗体的抗原特异性结合能力和寡核苷酸的基因调控功能，旨在实现对多种疾病的靶向高效治疗干预。尽管AOCs尚处于发展早期，但在过去几十年中进展稳步。本文旨在全面概述AOC治疗药物，包括作用机制、结构组件和制造工艺。此外，本文还将讨论当前的质量控制策略、现有局限性以及潜在的未来研究方向，以支持AOC治疗药物的进步。

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一、AOC的发展历程

1913年，诺贝尔奖得主、德国科学家Paul Ehrlich首次提出了“魔术子弹”的概念，即有毒物质（“弹头”）可以被装载到能够精确靶向癌细胞的载体上，以选择性杀死恶性细胞而不伤害健康细胞。2000年首个抗体-药物偶联物（ADC）Mylotarg的获批，极大地推动了药物开发行业。ADC等抗体修饰药物的出现，拓展了新药开发的范式。AOCs目前已成为前景广阔的靶向治疗药物。

AOCs的发展与RNA干扰（RNAi）疗法的发展紧密交织；过去三十年中，这两个领域都取得了显著进展。我们将AOC的发展进程分为五个不同的阶段。早期探索阶段从1995年持续到2005年。关于AOCs的第一项研究发表于1995年。1998年，Fire和Mello阐明了RNAi的机制，为基于siRNA的治疗药物奠定了基础，并于2006年获得诺贝尔生理学或医学奖。1998年，首个ASO药物福米韦生获批上市。尽管福米韦生已从美国和欧洲市场撤出，但其获批是核酸类治疗药物开发的开创性里程碑。

第二阶段是AOC技术发展阶段，从2006年到2014年。2010年，首次在人体中证明了siRNA对蛋白质表达的抑制，为基于siRNA的治疗药物开发提供了理论基础。2014年，基因泰克利用THIOMAB™技术将siRNA定点缀合到抗体上，为AOCs的开发奠定了基础。从2015年到2021年，AOCs进入临床突破阶段。2016年，首个磷酰二胺吗啉代寡聚物（PMO）药物依特立生获得监管批准，扩大了RNAi治疗领域，并为AOC开发提供了重要的寡核苷酸形式。2018年，首个siRNA治疗药物帕替司兰获批临床使用。2021年，首个AOC治疗药物AOC 1001进入临床试验。

从2022年开始，AOCs进入临床进展加速阶段。截至2024年，已有11种ASO药物、6种siRNA药物和2种适配体药物获批临床使用。2022年，多个AOC候选药物进入临床试验，包括DYNE-101、DYNE-251和TAC-001。2024年，AOC 1001被美国食品药品监督管理局（FDA）指定为突破性疗法。2025年，DYNE-101获得FDA快速通道认定。首个AOC治疗药物AOC 1001（或AOC 1044）预计将于2026年上市。

作为一种新兴的治疗技术，AOCs在全球范围内拥有显著的研究和开发势头。截至2025年3月，全球有31个AOC项目处于从临床前研究到III期临床试验的不同开发阶段。这些项目主要针对罕见病、癌症和神经退行性疾病。例如，由Avidity Biosciences开发的Delpacibart Etedesiran（AOC 1001）已进入III期临床试验，用于治疗强直性肌营养不良1型。这种基于RNAi的治疗药物包含一种抗转铁蛋白受体1（TfR1）抗体，能够实现寡核苷酸的靶向递送。Avidity Biosciences的其他AOCs，包括用于面肩肱型肌营养不良症的Delpacibart Braxlosiran（AOC 1020）和用于杜氏肌营养不良症的Delpacibart Zotadirsen（AOC 1044），目前正处于II期临床试验。这些疗法的开发突显了AOCs在治疗肌肉退行性疾病方面的技术优势。

由Tallac Therapeutics开发的用于治疗实体瘤的TAC-001目前处于I/II期临床试验。TAC-001靶向CD22抗原并结合TLR9激动剂以增强免疫反应。DYNE-101由Dyne Therapeutics设计，用于治疗强直性肌营养不良1型。DYNE-101由抗TfR1抗体的Fab片段缀合ASO组成，用于肌肉特异性递送。DYNE-251也由Dyne Therapeutics开发，由靶向TfR1的Fab片段缀合PMO组成。DYNE-251旨在促进向肌肉组织的靶向递送，并促进细胞核中的外显子跳跃，从而在肌肉细胞中产生截短但功能正常的抗肌萎缩蛋白。该疗法适用于适合外显子51跳跃的杜氏肌营养不良症患者。DYNE-101和DYNE-251目前均处于I/II期临床试验。由Aro Biotherapeutics开发的ABX1100是一种新型Centyrin-siRNA缀合物，它采用源自人腱蛋白C的小型稳定蛋白支架，靶向TfR1，将糖原合成酶1（GYS1）特异性siRNA有效载荷直接递送至肌肉组织，用于治疗晚发型庞贝病。ABX1100目前处于I期临床试验。

二、AOC的作用机制

1. 通过抗体实现靶向递送

已识别出多种抗原靶点，包括转铁蛋白受体、凝集素、受体酪氨酸激酶、整合素和HER2/EGFR。这些靶点使得能够递送至肌肉、中枢神经系统、肝脏和肿瘤细胞。TfR1是研究性AOCs中最常靶向的抗原。TfR1在大多数正常细胞中低水平表达，在具有高增殖率（如基底细胞）和高铁需求（如红系祖细胞）的细胞中显著上调。许多与癌症发病机制相关的基因会调节TfR1的表达。TfR1已在骨骼肌和罕见病、肿瘤学和帕金森病治疗的背景下进行了研究。在TfR1抗体识别靶点后，寡核苷酸的跨膜递送主要通过受体介导的内吞作用进行。

AOCs发挥细胞内作用的机制始于抗体部分与细胞表面其同源抗原的精确相互作用。这种高亲和力结合事件是细胞内在化的启动信号，主要通过受体依赖性内吞作用介导。抗原识别后，AOC-抗原复合物诱导质膜局部内陷，导致缀合物被包裹在称为内体的囊泡结构中。随着新生内体通过内吞途径进展，其经历成熟过程，其特征是管腔环境逐渐酸化——从早期内体的近中性pH到晚期内体和溶酶体中酸性环境的增加。这一成熟过程伴随着各种内体分选复合物和水解酶的募集，它们共同调节囊泡内条件。至关重要的是，这些内在的物理化学特性（如pH梯度和酶活性）会触发连接寡核苷酸和抗体的连接子的裂解。AOCs中的连接子通常被设计为对这些信号作出反应，包含酸不稳定键或蛋白酶敏感肽等元件。连接子解离后，释放的寡核苷酸必须穿过内体膜进入细胞质区室，这一步骤通常称为内体逃逸。这种逃逸机制对治疗成功至关重要，因为被困在内体中可能导致溶酶体降解和活性丧失。各种策略促进了这一过程，包括掺入融合肽或质子海绵聚合物，通过渗透膨胀或膜扰动破坏内体完整性。一旦释放到细胞质中，寡核苷酸就与其分子靶点结合以调节基因表达。根据寡核苷酸类型（如反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰RNA（siRNAs）或剪接调节剂），它可能与互补的mRNA序列杂交，从而募集内源性机制，如用于转录物切割的RNase H、用于转录后沉默的RNA诱导沉默复合物（RISC），或改变剪接模式以产生功能性蛋白质亚型。这种基因调控作用最终转化为表型变化，例如遗传性疾病中致病蛋白表达的减少或肿瘤学应用中免疫反应的增强。

尽管大多数靶向不同抗原的AOCs共享涉及网格蛋白介导的内吞作用的内在化共同机制，但内在化速率和内吞后运输各不相同。靶向TfR1的AOCs在小鼠骨骼肌中快速内在化。单次10 mg/kg注射后，24小时内超过80%的靶基因表达被敲低。相比之下，靶向TENB2的AOCs仅在肿瘤血管附近内在化，导致三天内仅33%的基因抑制。TfR1是一种循环抗原，内在化后将AOCs返回细胞表面，而HER2是一种降解抗原，将AOCs导向溶酶体进行降解。

寡核苷酸从内体逃逸的效率低下是一个重大的技术瓶颈。内体具有能够隔离和保留约99% RNA治疗药物的脂质双层。香港大学的研究人员使用定量NanoSIMS显微镜证实，体内只有1%到2%的GalNAc-ASO缀合物从肝细胞内体中逃逸。此外，RNA分子固有的亲水性和负电荷阻碍了它们穿过类似带电的细胞膜的易位。

2. 寡核苷酸的类药特性

传统的ADCs递送作用于特定细胞内分子靶点的细胞毒性有效载荷，以破坏关键的细胞机制。相比之下，AOCs中的寡核苷酸有效载荷作用于上游信号分子，例如内源性mRNAs，通过碱基配对互补特异性沉默靶mRNA，从而减少致病蛋白的产生。几种不同的机制已在临床上得到验证，包括内含子剪接调节（例如，用于治疗脊髓性肌萎缩症的ASO药物诺西那生钠）和RNA诱导沉默复合物的形成（例如，用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性的脂质纳米颗粒包裹的siRNA帕替司兰）。

与ADC制备相关的挑战包括异质性、连接子疏水性、聚集和连接子稳定性。药物的大小以及药物对最终缀合物整体电荷的贡献也显著影响ADC制备。AOCs在结构相似性和设计原理方面与ADCs共享。然而，寡核苷酸的偶联可能带来更大的挑战。例如，ADCs中药物-连接子部分的分子量通常小于2 kDa，而寡核苷酸通常超过10 kDa。因此，寡核苷酸对抗体的物理化学性质的影响比小分子药物更大。此外，寡核苷酸带负电荷的磷酸主链赋予其水溶性，并在偶联时改变抗体的整体电荷。带负电荷的寡核苷酸赋予AOCs与ADCs不同的电荷分布，因此需要专门定制的分析和表征方法，而不是直接用于ADCs的技术。

1. 抗体

抗体组件引导AOCs。将抗体的靶向能力与寡核苷酸的基因调控功能相结合，扩展了寡核苷酸的治疗潜力，实现了对致病蛋白的精确调节。用于AOCs的抗体应具备以下特征：对抗原具有高特异性和亲和力、高效快速的内在化以及良好的药代动力学特性。低免疫原性的单克隆抗体（mAbs）是携带寡核苷酸至肝外靶点并参与各种药理作用（如抗体依赖性细胞吞噬作用，从而实现寡核苷酸的肝外递送）的理想递送载体。

抗体类型：全长mAbs，尤其是免疫球蛋白G（IgG），是AOCs最常用的抗体。IgG分子分子量约为150 kDa，由两条重链和两条轻链组成，形成不同的Fab和Fc区。IgGs表现出高特异性、强亲和力和延长的半衰期。然而，IgGs相对较大的尺寸限制了渗透性，降低了IgG缀合的AOC向深层组织区域的浸润。全长抗体，包括IgGs，主要积聚在肿瘤血管附近的少数细胞层内，而不是深层组织区域。尽管存在这些挑战，AOC设计的进步正在利用全长mAbs的优势来克服此类限制并实现靶向递送。Avidity Biosciences正在推进Delpacibart Etedesiran的临床开发，该药物采用靶向TfR1的全长mAb实现肌肉特异性递送。

抗体片段，如Fab或scFv，越来越多地用于解决全长抗体组织渗透有限的问题。抗体片段通过完整抗体的酶消化或基因工程产生截短抗体而产生。抗体片段的分子量范围为25 kDa至50 kDa。抗体片段保留了高特异性和亲和力，并表现出增强的组织渗透性，但抗体片段的半衰期比全长抗体短。Sutherland等人证明，靶向癌胚抗原的抗体片段在体外肿瘤球体模型中显示出相对于完整IgG显著改善的渗透性。Dyne Therapeutics正在推进DYNE-101的临床开发，该药物采用结合TFR1的Fab实现肌肉特异性递送。

源自骆驼科物种的VHH抗体（纳米抗体）由单个可变域组成，分子量在12 kDa至15 kDa之间。与全长mAbs和片段化抗体相比，VHH抗体表现出更高的特异性和亲和力以及更优的组织渗透性，但半衰期更短。纳米抗体在注射后3至5小时内达到高肿瘤背景对比度，表明其能够快速渗透深层组织区域。使用VHH的AOC正成为一个热门研究领域。迄今为止，尚无相关药物进入临床试验。

抗体特异性和亲和力：理想抗体的独特分子结构是其对抗原靶点具有高特异性和适当亲和力的基础。Y形抗体包含两个可变区，由通过V(D)J重组产生多样性的互补决定区组成。互补决定区的独特构象确保了与靶抗原的精确匹配，这是高特异性和亲和力的基础。精确靶向可最大限度地减少脱靶细胞的非特异性摄取，从而降低AOCs的毒性并增强其治疗效力。适当的亲和力也增加了靶细胞摄取AOC的可能性，从而提高了整体效率。

药代动力学特性：将抗体与寡核苷酸偶联会导致相对于裸抗体的物理化学变化。这些改变可能影响药代动力学，应在AOC开发过程中仔细考虑。人源化抗体具有与未偶联抗体相似的药代动力学特性，越来越多地用于下一代ADC构建。人源化抗体为AOC设计提供了宝贵的指导；低免疫原性和最佳的药代动力学特性对抗体选择至关重要。

2. 寡核苷酸

寡核苷酸包括短的低分子量RNA或DNA分子及其合成类似物（异源核酸）。寡核苷酸在治疗、诊断和免疫调节方面具有多种应用，包括病原体检测、基因沉默和基因表达调节。寡核苷酸是AOCs的关键组成部分，体现了其药理作用。该组包括ASOs、小干扰RNA（siRNAs）、PMOs、微小RNA（miRNAs）和核酸适配体。其中，ASOs、siRNAs和PMOs得到了最广泛的研究。与作用于分子靶点以实现所需表型的传统ADC小分子有效载荷不同，当前的合成寡核苷酸治疗药物靶向上游信号分子，例如内源性mRNAs。寡核苷酸通过碱基配对互补特异性沉默靶mRNAs，以减少致病蛋白的产生。

ASOs：ASOs是通过碱基互补靶向mRNA或pre-mRNA以调节基因表达用于治疗目的的单链核酸分子。AOCs中的抗体靶向递送可显著增强传统ASO疗法的效力和安全性。AOC作用的主要机制包括与靶RNA特异性结合，诱导RNase H介导的RNA降解，或通过空间位阻抑制RNA剪接和翻译，从而调节特定基因的表达。例如，用于治疗脊髓性肌萎缩症的ASO药物Spinraza（诺西那生钠）通过调节SMN2基因的表达来增加SMN蛋白的产生。Spinraza在脊髓性肌萎缩症患者的临床试验中实现了持续的治疗获益。对于AOCs，1995年首次报道的AOC使用ASO作为核酸分子。近年来，几种AOCs已进入临床试验，并使用ASOs，一个显著的例子是DYNE-101。

小干扰RNA（siRNAs）‍：研究最广泛且临床应用最广泛的寡核苷酸是siRNAs。双链siRNAs通常为21至23个碱基对。反义链与靶mRNA完全互补，并通过RNA诱导沉默复合物介导靶mRNA的降解以沉默基因。Inclisiran是一种已批准的siRNA分子，具有已证实的效力和安全性，可干扰前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）的mRNA，导致该蛋白和低密度脂蛋白胆固醇的持续降低。与传统小分子药物相比，siRNAs表现出更高的特异性和更广的靶点谱，能够精确干预小分子难以靶向的蛋白质或基因。然而，与ASOs相比，siRNAs通常表现出较低的组织渗透性。许多临床试验中的AOCs使用siRNA作为有效载荷，例如Avidity开发的Delpacibart Etedesiran和Delpacibart Braxlosiran。

PMOs：PMOs是合成的单链DNA类似物，其中天然的磷酸二酯键被磷酰二胺键取代。每个PMO亚基中的吗啉环赋予其增强的稳定性和对酶降解的抵抗力。PMOs主要通过互补结合pre-mRNAs以阻断剪接体对靶功能蛋白特定外显子的识别来调节基因表达。PMO结合诱导外显子跳跃并恢复功能蛋白的翻译。2016年批准的Eteplirsen（EXONDYS 51®）是一种基于PMO的反义寡核苷酸，用于治疗确诊DMD基因突变且适合外显子51跳跃的杜氏肌营养不良症患者。尽管PMOs是AOCs中最新使用的寡核苷酸类型，但它在该领域发挥着重要作用。Avidity开发的Delpacibart Zotadirsen使用PMO作为AOC的寡核苷酸部分。

寡核苷酸的修饰：作为生物大分子，寡核苷酸在进入生理环境时会面临一些挑战，这些挑战限制了它们的治疗效力，包括稳定性差和易受血清核酸酶降解。AOCs通常携带寡核苷酸有效载荷。对寡核苷酸骨架、糖部分和核碱基的修饰包括骨架重组、糖环改变、末端加帽和5'磷酸化。这些修饰提高了寡核苷酸的稳定性和治疗效力。寡核苷酸化学和偶联技术的重大进步促进了多种寡核苷酸缀合物的开发，用于临床候选药物。

3. 连接子

连接子在AOC的靶向抗体和治疗性寡核苷酸之间建立高效且可控的化学桥梁。连接子显著影响AOCs的关键参数，包括寡核苷酸-抗体比率（OAR）、治疗指数、药代动力学/药效学以及整体稳定性。因此，连接子的设计和选择需要综合考虑稳定性、可控释放和生物相容性等多种因素。

连接子大致可分为可裂解和不可裂解两种类型。可裂解连接子在特定生理条件下释放药物，可进一步分为酶敏感型、酸敏感型和还原敏感型亚型。酶敏感型连接子可以基于溶酶体的独特微环境进行设计。例如，水解酶如组织蛋白酶特异性裂解基于肽键的连接子（如Val-Cit），磷酸酶降解磷酸酯基连接子。连接子的肽序列或化学结构必须在血浆中的稳定性与细胞内高效裂解之间取得平衡。寡核苷酸的释放也可由酸性条件（内体中pH 5.5，溶酶体中pH 4.5）或还原环境触发。常见的酸敏感型连接子包含肼、缩醛和碳酸酯键。细胞内谷胱甘肽浓度升高诱导二硫键的选择性裂解；因此，连接子的稳定性可以根据缀合位点和空间位阻程度进行微调。

不可裂解连接子提高了偶联稳定性，适用于需要长时间循环和持续活性的疗法。常见的偶联策略包括与天然氨基酸（如半胱氨酸或赖氨酸）共价连接、形成马来酰亚胺-硫醇连接（例如通过SMCC）以及使用点击化学方法（例如铜催化的叠氮-炔环加成或应变促进的叠氮-炔环加成）进行定点偶联。

直接偶联：直接缀合是AOC设计中最常用的缀合方法。在寡核苷酸上引入官能团允许其直接连接到抗体上。化学修饰的多样性支持使用多种连接子，包括可裂解和不可裂解连接子以及先前经过验证的ADC连接子。针对抗体上特定结合位点设计的连接子可以有效调节OAR，并且可以更小，与较大的连接子相比，对AOCs整体物理化学性质的影响更小。然而，这种方法需要在寡核苷酸上构建连接子附着位点，然后通过化学缀合将连接子连接到该位点。因此，直接缀合的通用性依赖于连接子的高稳定性，该连接子必须与DNA或RNA分子及其双链退火过程兼容且稳定。

在当前ADCs中，主要的偶联基团包括赖氨酸和半胱氨酸残基，近年来半胱氨酸基偶联的使用显著增加。类似地，AOCs目前主要利用半胱氨酸残基作为关键偶联基团，利用其反应性硫醇部分高效附着寡核苷酸有效载荷，特别是通过工程化半胱氨酸实现定点偶联，从而精确控制OAR值、偶联位置，并促进靶向递送应用以增强治疗效力。Cochran等人比较了AOCs的不同连接子方法。为此，他们采用了三种不同的抗体与寡核苷酸偶联方法：1）半胱氨酸偶联，2）赖氨酸偶联，3）Asn297糖基化偶联。为了实施基于半胱氨酸的方法，他们用TCEP处理抗体以切割链间二硫键，暴露半胱氨酸残基上的硫醇基团，然后使siRNA与含马来酰亚胺的连接子MCC反应，形成siRNA-连接子-马来酰亚胺中间体，随后通过硫醇-马来酰亚胺反应偶联到抗体上。结果表明，通过半胱氨酸偶联构建的AOCs在药代动力学和siRNA递送效率方面优于其他方法，因为赖氨酸偶联导致血浆清除更快，而Asn297糖基化缀合虽然稳定，但血浆暴露较低。

点击化学是美国化学家Barry Sharpless于2001年引入的现代有机合成策略，并于2022年获得诺贝尔化学奖。点击化学因其高效、优异的选择性、模块化和温和的反应条件而被用于构建AOCs。点击化学的一个显著例子是使用应变促进的叠氮-炔环加成。在这种方法中，抗体用DBCO-PEG5-NHS修饰，寡核苷酸的5'端通过标准固相合成功能化叠氮基团（-N₃）。抗体和寡核苷酸通过DBCO和叠氮的应变促进叠氮-炔环加成快速偶联。这种由点击化学实现的模块化设计，便于在实验过程中灵活交换不同的抗体和寡核苷酸，并支持抗体与各种寡核苷酸的正交偶联，为经济高效且可扩展的AOC生产提供了支持。

亲和力偶联：亲和力偶联的一个典型例子是利用亲和素和生物素之间的高亲和力，将siRNA稳定偶联到靶向抗体上。在这项研究中，正义siRNA链在3'端单生物素化，并与靶向人胰岛素受体的重组链霉亲和素和mAb的缀合物组装。使用转染了荧光素酶报告基因的人293上皮细胞来监测基因表达并表征该构建体。AOC构建成功，AOC处理在48小时内使荧光素酶表达显著降低超过90%。RNA干扰作用持续长达5天，但在7天后消失。在siRNA浓度低至3 nM时可检测到抑制作用，并且抑制效果随siRNA浓度增加而增加（半数抑制常数约为30.5 ± 11.7 nM）。这些发现表明，亲和素-生物素系统是构建AOC的高效且稳定的连接子。

通过离子相互作用偶联：离子相互作用偶联利用寡核苷酸骨架的负电荷，通过离子相互作用与修饰有多聚阳离子结构的抗体偶联。最常用的多聚阳离子部分是内源性蛋白鱼精蛋白。Liberman等人首次报道了通过离子相互作用缀合构建AOCs的方法。来自靶向HIV-1包膜蛋白的mAb F105的重链Fab片段与鱼精蛋白基因融合，生成融合蛋白F105-P。将F105-P与siRNA孵育得到AOC。siRNA的荧光标记显示，每个鱼精蛋白分子稳定结合大约六个siRNAs。构建的AOCs证明了有效的靶向和基因沉默，而不会触发干扰素反应。这项研究证实了离子相互作用缀合用于AOC构建的潜力，并突出了这种方法的简单性。多聚阳离子部分也充当溶酶体逃逸剂，并通过“质子海绵”效应诱导溶酶体渗透膨胀，增加膜通透性并促进寡核苷酸释放到细胞质中。

尽管简单，离子相互作用偶联存在固有的不稳定性。离子键的可逆性使得缀合物在生理pH或盐度变化下容易解离，可能导致寡核苷酸过早释放。此外，由于依赖于间接表征方法，如荧光标记或PCR，质量控制尤其具有挑战性，这通常导致批次间差异大，并难以确保产品一致性。最后，缺乏全面的体内稳定性数据，包括ADME谱，引入了释放动力学的不确定性，增加了脱靶效应和降低治疗效力的风险。因此，上述挑战导致离子相互作用偶联在当代AOC研究中很少使用。