我国已有6个寡核苷酸药品进口，产品名称及批准进口时间分别是诺西那生钠（nusinersen sodium，Spinraza，2019年）、英克司兰钠（inclisiran sodium，Leqvio，2023年）、托夫生（tofersen，Qalsody，2024年）、芬妥司兰钠（fitusiran sodium，Qifilia，2025年）、依普隆特生（eplontersen，Wainua，2025年）、普乐司兰钠（plozasiran sodium，Redemplo®，2026年），另有多个产品已进入或完成关键临床试验。

目前人用药品技术要求国际协调理事会（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH）尚未发布专门针对寡核苷酸药物的指导原则；ICH已实施的指导原则中，适用寡核苷酸药物的指导原则包括ICH Q1A、ICH Q1B、ICH Q2、ICH Q3C、ICH Q3D、ICH S9等，本类药品稳定性研究、分析方法验证、残留溶剂、元素杂质等药学研究可参考相关ICH指导原则进行；ICH很多药学指导原则明确不适用或部分不适用于该类药物，如ICH Q3A、Q3B、Q6A、M7等，针对这些药学研究内容尚无国际协调的通用方法。

现阶段各国药品监管机构正在积极进行寡核苷酸药物药学方面的指导原则建设。欧洲药品管理局(EMA)2024年7月公开了《寡核苷酸药物开发和生产指导原则草案》^[8]，现处于征求意见阶段；日本药品和医疗器械管理局(PMDA)于2018年发布《寡核苷酸治疗的质量保证和评估要点》，概述了寡核苷酸治疗质量和评估的关键考虑因素^[9]；PMDA于2020年3月发布了《寡核苷酸治疗产品非临床安全性评价指导原则》，主要内容是本类药物非临床安全性评价方面的一般考虑，其中对杂质研究等药学问题提出了一些观点。美国食品药品监督管理局（FDA）目前发布了5个关于寡核苷酸药物的行业指南，主要针对临床试验申报、临床药理学、非临床等方面^[10]。美国FDA等监管机构认为此类产品监管方面面对的挑战包括其多种不同的化学结构和作用机制、不同的毒理学特征、杂质表征困难且杂质与主成分结构相近等，建议根据质量方面的指导原则，结合核酸特有的性质和结构特点，进行此类产品的监管^[11]。

对于按照化学药品申报的寡核苷酸药物，可基于常规小分子化学药品指导原则相关理念进行研究和开发。考虑核酸产品特点，基于笔者对国内外相关文献、我国指导原则建设、已上市药品实际审评经验，就原料药生产工艺、制剂开发、质量控制以及临床试验期间变更等研发关键内容进行综述。

天然的核酸在人体内易被核酸酶降解，很难进入细胞内发挥药理作用，因此需要对核苷酸进行化学修饰。常见的修饰类型包括磷酸二酯键中的氧被硫取代修饰、糖环修饰（包括2位羟基采用甲氧基、氟、甲基乙基修饰或2脱氧修饰、2与4形成桥环修饰）、碱基修饰（嘧啶环C5位甲基取代）。这些化学修饰可在起始原料中引入、在核酸合成过程中引入（如硫代修饰）^[12]。

寡核苷酸药物的基本组成单元为核苷酸，单个核苷亚磷酸胺具有明确的结构和理化性质，可从市场上购得，通常被视为合适的起始物料^[13-14]，核苷亚磷酸胺起始原料的质量控制项目通常包括：外观、鉴别、含量、杂质、纯度、水分和残留溶剂。起始原料中部分杂质可参与后续反应，这些反应性杂质通常会在最终的原料药中持续存在，且下游处理和纯化步骤通常无法完全去除，宜按特定杂质进行必要控制，另起始原料的质量可能对合成顺利进行有较大影响^[12]。

为避免体内降解、靶向输送药物，以及减少免疫原性和脱靶效应等原因^[15]，本类药物常在核酸基础上设计适宜的递送策略，现常见的递送策略包括原料药包含递送基团、制剂开发适宜的递送载体^[16]两种方式。现使用最广泛的递送方式为N-乙酰半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine，GalNAc)修饰。GalNAc是唾液酸受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)的靶向配体，可以与肝脏实质细胞表面的ASGPR特异性结合并被细胞胞吞，实现肝靶向的目的^[17]。

GalNAc分子及固相载体与GalNAc连接整体是否可指定为起始原料，目前业界还存在一定争议，一些观点认为结构相对经典的GalNAc分子可指定为起始原料^[13]，其常见质量控制项目包括性状、鉴别、水分、残留溶剂、含量、杂质和纯度等。

生产涉及使用的化学试剂，如去三苯甲基保护基试剂（如二氯乙酸、三氯乙酸）、偶联试剂（如四氮唑、碳二亚胺）、清洗剂（如乙腈）、脱保护基（如氨水）、硫化试剂（如硫化氢），寡核苷酸生产所使用的其他物料，如固体载体、溶剂和色谱填料等，也可能对产品质量产生影响^[18]。另外，根据已上市产品的研发经验，固体载体（非预负载载体）是固相合成法的关键物料，常用的载体包括控制孔径玻璃（CPG）和聚苯乙烯树脂，质量控制项目主要包括外观、成分、粒径、负载量（如单位质量载体具有的可连接基团数量）、孔径、交联度、膨胀体积等（如涉及）。

寡核苷酸通常采用计算机控制的自动合成仪生产，合成仪由一系列泵、阀门、工艺管道和流量计组成，用于将起始物料和试剂溶液送入装有固体支持物的柱状反应器中，溶剂、试剂和起始物料溶液都采用相应的配液罐密闭接入合成仪。典型工艺为以固相载体上相应基团为起始，经4个合成步骤多次循环，将核苷亚磷酰胺单体沿3′至5′方向逐一连接至寡核苷酸链上，从而获得目标序列的单链核酸^[19]。上述循环步骤具体为：脱保护[脱除核糖5′位置的4,4-二甲氧基三苯甲基（DMT）保护基，暴露5′-羟基连接位点]、偶联（与下一个核苷亚磷酰胺偶联得到亚磷酸二酯）、氧化/硫代[亚磷酸二酯不稳定，此步骤将亚磷酸二酯中Ⅲ价磷氧化为Ⅴ价的磷酸酯（PO）或硫代磷酸酯（PS）]、封端/加帽[加入酰化试剂（通常为酸酐），与未反应的羟基反应，避免羟基参与后续反应]^[19-20]。目前本领域固相合成工艺已形成了一些合成、分离纯化等通用的平台经验^[19]，可供开发者借鉴。

在固相合成完成后，通过脱保护反应（如氨解反应）将核酸链与固相载体切除并脱除保护基团。从固相载体解离下来的核酸纯度较低，目标产物可能仅占所有核酸的很小比例，含有大量杂质且杂质与主成分化学结构相近，通常需采用色谱法进行分离纯化。常见纯化方式包括基于离子交换机理的分离纯化方法[如强阴离子交换色谱（SAX）法]、基于极性的分离纯化方法[如反向高效液相色谱（HPLC）法、反向中低压制备色谱法]等^[19,21]。

纯化完成后，后续典型的产物分离步骤包括从水溶液中沉淀（通过添加乙醇）、超滤-渗滤、薄膜蒸发和冷冻干燥等操作。经过超滤、渗滤等操作进行脱盐和浓缩，例如通过配备膜的切向流过滤设备，根据膜的孔径截止尺寸去除残留的有机溶剂、盐和低相对分子质量杂质。对于双链核酸还涉及两条单链核酸偶联步骤（退火）。单链的退火可自发发生，反应条件较为温和，常见影响退火步骤的工艺参数包括退火温度或温度梯度、盐浓度、两单链核酸采用合理的定量方式按正确的比例进行混合等^[8,19]。

随着技术的进展，本领域也在不断改进生产技术，例如，部分开发者开发了3步循环的核酸固相合成工艺，在减少循环操作的同时保证了产品质量^[22]；为提高产品纯度、降低杂质水平等原因，部分企业开发了固相合成与酶连接相结合的核酸制备工艺^[23]。这些新工艺制备产品的质量经评估不低于经典固相合成工艺所得的产品质量。

本类药物通常考虑设备生产能力、拟申报适应证的患者人群及用药量等综合考虑设定生产批量。例如孤儿药、罕见病用药等领域，因市场需求相对较少，创新药批量可能设定较小。

根据笔者对思拓凡（CYTIVA）核酸合成仪厂家及多家药企调研结果，寡核苷酸原料药合成规模取决于固相载体载量、合成柱以及合成仪等设备因素。现设备供应商已可提供最大1800 mmol（约>7 kg）的商业化生产设备；另原料药批量也可能受纯化设备限制，如中低压纯化设备（如离子交换纯化）、高压纯化设备（如制备HPLC纯化）等。

寡核苷酸药物具有相对分子质量大、高亲水性/脂溶性差、带有负电荷的特性，且天然结构的核酸在体内易发生酶解、无法自由进入细胞、无法通过血脑屏障。上述特点导致此类产品通常口服生物利用度较低，现多开发为注射液剂型，给药途径包括皮下注射、鞘内注射等。目前也有多家企业正在研究开发脂质纳米粒等递送系统，此类产品依据所选择的递送系统（载体），关注递送效率、微观形态表征及其他制剂关键质量属性，参考相关指导原则对产品进行设计和开发^[24]。

根据美国FDA网站批准信息，现有已上市产品（含已撤市）处方多数较为简单（表2），如仅包括注射用水或简单的缓冲溶液体系；部分鞘内注射的药品，例如诺西那生钠注射液，处方中采用人工脑脊液作为溶剂。考虑到原料药在高温下的降解，本类药物一般不能耐受终端灭菌，通常采用过滤除菌工艺^[25]。

表2 部分寡核苷酸产品处方

本类产品质量控制项目通常参照ICH Q6A的基本原则，在常规项目的研究基础上，根据寡核苷酸的制备工艺、结构特点、理化性质合理设定。原料药质量研究项目一般应包含外观、鉴别、水溶液的pH值、纯度和有关物质、反离子含量、水分、细菌内毒素、微生物限度、含量等，并对残留溶剂、元素杂质、致突变杂质进行风险评估，制定合理的控制策略^[26-27]。根据笔者经验及相关文献^[8,11]，制剂质量标准一般应包括性状、鉴别、澄清度与颜色、pH值、降解杂质、装量/装量差异、可见异物、渗透压物质的量浓度、不溶性微粒、细菌内毒素、无菌、含量测定等控制项目。如经确认方法适用，制剂部分检测项目可直接采用与原料药相同或相近的分析方法，如鉴别、纯度、杂质、含量、立体异构体、生物活性等。

为提高专属性，常采用不同原理的方法进行鉴别，通常包括证明核苷酸序列与理论序列一致的鉴别方法。

本类药物结构复杂，根据产品特点，杂质研究和控制有很多特殊之处[22]。寡核苷酸有关物质的来源主要包括起始原料引入、生产过程中形成、生产或储存过程中降解产生。常见的寡核苷酸有关物质包括：缺失序列（缺少1个或多个核苷酸，常描述为N-x杂质，如N-1杂质、N-2杂质等）、插入序列（存在1个/多个额外的核苷酸，常描述为N+x杂质，如N+1杂质等）、硫代不完全杂质（PS寡核苷酸中的PO杂质）、糖环异常杂质（糖环取代基位置异构体的混合物）、碱基异常杂质（如碱基乙酰化、脱嘌呤/脱嘧啶杂质）等^[28]。

由于部分寡核苷酸有关物质的结构、性质与主成分较为相似，杂质分离难度较大，不太可能像常规小分子化学药品一样实现完全的杂质归属和杂质分离。常见解决办法包括针对不同种类杂质结构和特点（相对分子质量、电荷、极性等）开发不同原理的分析方法。常见检测方法包括离子对反相高效液相色谱（IP-RP-HPLC）、离子交换色谱（IEX-HPLC）、液质联用（LC-MS/MS）、毛细管电泳（CE）、分子排阻色谱（SEC）、亲水相互作用色谱法等，所采用的检测器包括紫外（UV）、质谱（MS）[如电喷雾电离（ESI）]检测器等^[28-29]。近年来，IP-RP-HPLC技术的使用已变得更加广泛，已成为一种常用的检测技术[30]。多种不同原理分析方法组合使用，可提高杂质检测能力；另外，一些先进的、具有更佳专属性的分析方法也在不断出现，如高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS-MS）技术可实现对相同保留时间的杂质峰进一步解析。另考虑按杂质保留时间对杂质分组进行控制。

对于双链寡核苷酸，可采用非变性方法（如非变性IP-RP-HPLC、SEC、CE等）对单链的残余量进行分析和控制；采用变性方法考察纯度和杂质。杂交后的双链杂质分析相对困难，可结合单链核酸中间产品质量控制，建立整体质量控制策略。

根据相关文献报道，寡核苷酸产品杂质限度建议为报告限度0.2%、鉴定限度1.0%、界定限度1.5%^[8,28]。对于超过界定限度的杂质，根据杂质结构是否与主要代谢物结构相同、是否为天然存在的核酸结构、是否由活性成分寡核苷酸的序列变化得到、是否含有活性成分以外的核苷酸或非天然核酸结构元素，综合评估并合理制定控制策略，对于存在风险的杂质进一步进行动物安全性评估。

因本类产品有关物质控制专属性不及小分子化学药物，因此含量测定方法对产品质量控制更加关键。含量测定常见方法为UV法或HPLC法。HPLC法专属性较强，定量更加准确。

通常结构简单、长度较短的单链或双链核酸，产生核酸高级结构的可能较低。而适配体等核酸链长度较长、结构相对复杂，通常通过二级结构及高级结构检测、生物活性测试的方法证明产品质量可控。

寡核苷酸药物的开发遵循创新药研发的一般规律，考虑本类产品药学变更可能对产品质量产生较大影响，监管方面建议尽早确定产品的生产工艺、批量等药学信息，避免临床试验期间进行不必要的药学变更。针对确需进行药学变更的情形，通常研发思路是结合所处的产品开发阶段、变更的性质、先验知识和经验等进行风险评估，并进行必要的可比性研究。药学可比性研究的目的在于证明药学变更前后产品的关键质量属性一致。通常，可比性研究可能包括3个方面考虑：

① 对变更前后生产的产品进行全面的结构确证，确认变更前后产品等同。

② 需进行充分的质量对比研究，通常应对质量标准控制项目和产品其他关键质量属性进行检测，如原料药含量、杂质、反离子等；制剂含量、杂质、异构体等。变更前后产品杂质谱、非对映异构体组成（即各种异构体所占比例）^[31]应具有可比性。

③ 进行变更前后产品的稳定性研究。

如果原料药的药学变更可能影响到制剂的生产工艺或产品质量，通常需要对原料药及其制剂同时进行评估。当药学评估结果表明变更会对产品的安全性或有效性产生风险时，可进一步评估并考虑开展非临床和临床桥接研究。

国内寡核苷酸类产品研发和申报数量均呈现上升趋势。目前欧美发达国家在寡核苷酸类产品研发领域处于领先地位，有上百个此类药物处于临床研究状态，通过快速验证潜在治疗靶点的有效性，借助孤儿药、快速通道、加速审批、优先审评和突破性疗法等多条特殊认定和审评途径，实现药物的快速获批和上市。我国在该领域相关研究也较为活跃，在政策扶持和科研投资推动下，多家国内企业正积极布局，在肿瘤、乙型肝炎和高血压、高血脂等慢性病领域已取得了较大进展。

寡核苷酸类产品研发难度较大且新技术、新产品不断涌现，随着国内外指导原则的制定和最终发布，我国对此类品种技术要求也在不断完善。