一、引言

亚硝胺类杂质是近年来药品质量领域最受关注的基因毒性杂质之一。自2018年7月在缬沙坦原料药中首次检出N-亚硝基二甲胺（NDMA）以来，陆续在其他沙坦类原料药中检出了各类亚硝胺杂质。此后，雷尼替丁、二甲双胍、利伐沙班等多种药物中也相继检测到亚硝胺类杂质，引发了全球范围内的药品召回和监管关注。

亚硝胺类杂质属于ICH M7指南中明确提出的具有较高致癌性（“关注队列”）的物质，应在药品中予以严格控制。亚硝胺在人体内通过细胞色素P450催化，其α-碳原子被羟基化，随后降解产生重氮离子或烷基正离子，这些活性中间体能够通过破坏染色体结构、影响细胞分裂和DNA表达等方式发挥致癌作用。由于亚硝胺类杂质的可接受摄入量通常以纳克/天计（如NDEA仅为26.5ng/天），其对分析方法的灵敏度和工艺控制水平提出了极高要求。

理解亚硝胺杂质的生成机理，是从源头控制和降低其风险的基础。本文从原料药合成和制剂生产两个维度，系统阐述亚硝胺杂质的生成途径，并结合CDE发补案例进行分析。

二、亚硝胺杂质生成的核心条件与化学基础

亚硝胺杂质的生成需满足三大核心条件：一是易反应胺结构的存在，二是亚硝化试剂的参与，三是适宜的酸性反应环境。

2.1 胺类前体

亚硝胺杂质可以通过仲胺、叔胺或季胺与亚硝化试剂在特定条件下通过亚硝化反应形成。其中：

• 仲胺是最受关注的前体，因为仲胺可直接与亚硝化剂反应形成稳定的亚硝胺。仲胺共轭酸的pKa会影响亚硝化速率——pKa较低的胺即使在亚硝酸盐浓度较低时也更容易被亚硝化。

• 叔胺可通过多种途径降解生成仲胺，进而具备亚硝胺杂质生成的结构基础。简单的非活化叔胺通过两步亚硝化诱导脱烷基化及后续亚硝化机制形成亚硝胺，其反应性约为相应仲胺的1/1000。

• 季胺因配位饱和且带正电荷，无法直接形成亚硝化所需的初始中间体，但部分季铵盐（主要是含甲基或苄基取代基的）在特定条件下会发生脱烷基化，生成相应的叔胺，进而可能被亚硝化。

一项大规模分析发现，药物数据库中41.4%的活性药物成分（API）和33%的杂质是仲胺或叔胺。这意味着大量药物分子本身就具备形成亚硝胺杂质的结构基础。

2.2 亚硝化试剂

亚硝化试剂的来源多样，包括：

• 直接作用的亚硝化剂：如亚硝酸（HNO₂）、亚硝酰卤、三氧化二氮（N₂O₃）、四氧化二氮（N₂O₄）和有机亚硝酸酯等。

• 间接作用的亚硝化剂：如无机亚硝酸酯等。

• 亚硝酸盐在酸性条件下可原位生成亚硝酸，进而参与亚硝化反应。

三、原料药合成阶段的亚硝胺生成途径

原料药合成是亚硝胺类杂质产生的主要来源之一。

3.1 胺类化合物直接亚硝化

药物合成中使用的二级或三级胺可与亚硝化剂（如亚硝酸盐、氮氧化物）反应生成亚硝胺。例如，缬沙坦原料药中NDMA的检出，即源于合成过程中胺类中间体与亚硝酸盐在酸性条件下的亚硝化反应。NDSRIs（与药物结构相关的亚硝胺类杂质）正是通过含有二级、三级或四级胺的API（或API片段）在暴露于亚硝化化合物时发生亚硝化而形成的。

3.2 溶剂的降解参与反应

某些溶剂在特定条件下可降解生成胺类物质，进而参与亚硝化反应。最典型的例子是二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基乙酰胺（DMAc） ，在特定条件下降解产生二甲胺，进而与亚硝化剂反应形成NDMA。

沙坦类药物在合成过程中普遍使用DMF作为溶剂，在特定条件下DMF会分解产生二甲胺，当体系中存在亚硝酸盐时，二甲胺与之发生N-亚硝化反应生成NDMA。此外，N-甲基吡咯烷酮（NMP）在溶剂回收过程中可能水解生成仲胺，进而与亚硝酸盐反应生成亚硝胺杂质。

3.3 催化剂残留物的参与

合成过程中使用的某些催化剂（如含硝酸盐的金属催化剂）可能促进亚硝胺的形成。催化剂中残留的硝酸盐或亚硝酸盐可作为亚硝化剂的来源，在后续步骤中参与反应。

3.4 污染引入

原料药生产过程中使用了被亚硝胺类杂质污染的物料（起始物料、中间体、溶剂、试剂、催化剂等）可能带来亚硝胺类杂质的风险。回收溶剂、回收试剂和回收催化剂的使用若未经充分评估和控制，也可能成为亚硝胺杂质的来源。

四、制剂生产与储存阶段的亚硝胺生成途径

亚硝胺杂质不仅可能来源于原料药合成阶段，还可能在制剂阶段由多种因素引发。

4.1 辅料中亚硝酸盐的污染

这是制剂阶段亚硝胺生成的最主要途径。某些辅料可能含有亚硝酸盐杂质，与药物分子中的胺基团反应形成亚硝胺。研究表明，辅料中痕量亚硝酸盐（平均约1 ppm）是制剂中亚硝胺的主要来源之一。

淀粉类辅料是典型的例子。淀粉是农作物的加工品，可能含有微量的硝酸盐和亚硝酸盐，亚硝酸盐在特定条件下可能与胺类化合物反应生成亚硝胺。原淀粉和改性淀粉类药用辅料中的硝酸盐与亚硝酸盐控制，已成为药物制剂亚硝胺杂质风险控制的重要组成部分。

4.2 药物自身的降解

某些药物本身会降解产生亚硝胺类杂质。雷尼替丁是其中最典型的案例——雷尼替丁含有叔胺基团，在固态和液态下都缺乏稳定性，易于光介导降解。雷尼替丁会发生自我分解，导致储存过程中亚硝酸盐浓度增加，反应速率受热影响显著。雷尼替丁在高温下会产生亚硝胺类杂质。研究还发现，药物制造过程中产生的固态活性物种是雷尼替丁降解形成NDMA的关键因素，这些工艺包括结晶、研磨等机械处理。

原料药相关的亚硝基杂质是原料药的降解杂质，可能会随着样品贮存时间而增大。

4.3 含叔胺结构API的降解途径

含叔胺结构的API需要通过降解转化为仲胺后才能形成亚硝胺杂质。叔胺降解为仲胺的途径主要包括：

• 氧化脱烷基化：由体系中痕量氧气引发，易受光照、金属离子等因素催化。叔胺分子中的氮原子被氧化生成胺氧化物，随后在加热或储存条件下发生分子内消除，C-N键断裂后转化为仲胺。

• 酸催化消除：当药物制剂中存在微量酸性杂质时，叔胺氮原子接受质子形成季铵盐，随后在酸性环境中C-N键断裂，直接生成仲胺。

• 自由基反应：由过氧化物杂质或光照引发，导致C-N键均裂，生成仲胺。

含叔胺结构的典型药物包括左氧氟沙星、利多卡因、达沙替尼、文拉法辛、克拉霉素、西地那非等多个品种。左氧氟沙星可能降解生成N-亚硝基-去甲基左氧氟沙星，利多卡因可能降解生成N-亚硝基-去乙基利多卡因。

4.4 包装材料的贡献

包装材料也可能成为亚硝胺杂质的来源。EMA发现，采用含有硝化纤维的泡罩包装与含胺的印刷油墨可产生亚硝胺杂质，当泡罩热封时汽化冷凝转移至制剂表面。部分泡罩包装材料含有亚硝酸纤维素，当与含胺类印刷油墨接触时，在热封过程中可能发生化学反应生成亚硝胺。

4.5 生产环境因素

生产环境中的氮氧化物（可能来自空气污染或某些生产过程）可作为亚硝化剂参与反应。某些微生物能够将硝酸盐还原为亚硝酸盐，增加亚硝胺形成的风险。使用经氯胺消毒的水，在含仲胺或叔胺的条件下也可能形成亚硝胺。

五、亚硝胺杂质的发补案例分析

5.1 发补的法规背景

国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）分别于2019年发布《关于在原料药工艺中生成亚硝胺类化合物的风险警示》，2020年出台《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则（试行）》，明确了亚硝胺类遗传毒性杂质的研究要求与技术规范。此后，CDE针对亚硝胺杂质的发补与日俱增。

5.2 常见发补类型

（1）仅研究NDMA、NMBA等少数目标物，未进行全面评估

部分制药企业的亚硝胺杂质分析仅将NDMA、NMBA作为目标物，未提供全面的亚硝胺杂质评估分析及控制策略，也未说明分析方法的建立依据。然而，亚硝胺杂质的产生与化合物的合成工艺路线密切相关，不同API可能形成不同的NDSRIs，需要结合具体结构进行全面评估。

（2）含仲胺/叔胺结构的API未进行NDSRI风险评估

典型发补表述为：“本品原料药结构中含仲胺。请参考国际药品监管机构发布的亚硝胺杂质相关技术要求和亚硝胺杂质清单信息（如FDA公布的n-亚硝基-地氯雷他定（AI值为400ng/day）等），对本品的相关亚硝胺杂质进行风险评估，可定向合成潜在的NDSRI，采用高灵敏的分析方法（如MS-MS）进行研究和确认”。

（3）制剂中未考虑辅料和包材引入的亚硝胺风险

制剂采用同一条生产线应防止交叉污染引入亚硝胺杂质，药品辅料和内包材污染也是产生亚硝胺杂质的可能途径。有发补要求“参考国际药品监管机构（包括WHO等）发布的亚硝胺杂质相关技术要求及相关亚硝胺杂质清单，对本品制剂中可能形成的亚硝胺杂质（NDSRI，如亚硝基哌啶杂质等）进行风险评估和研究”。

（4）分析方法灵敏度不足

亚硝胺杂质在人体中的可接受限度较低，分析方法的高灵敏度是准确定量的关键。指南规定亚硝胺杂质的检测需要使用定量限为十亿分之一（ppb）级别的方法。目前USP及EP已收载的亚硝胺检测方法均采用液相/气相与质谱联用的方法。

5.3 典型案例

案例一：富马酸伏诺拉生——含仲胺结构API的NDSRI研究

发补要求对富马酸伏诺拉生中19种基因毒杂质进行研究。该品种原料药结构中含仲胺，审评要求参考国际监管机构发布的亚硝胺杂质相关技术要求，对相关亚硝胺杂质进行风险评估，定向合成潜在的NDSRI，采用高灵敏分析方法进行研究确认。

案例二：他达拉非——NDSRI对照品及方法学验证

CDE对他达拉非亚硝胺杂质发补要求进行相关研究，发补内容建议参考FDA、EMA等药品监管机构发布的亚硝胺杂质相关技术要求及亚硝胺杂质清单信息。

案例三：苯磺酸氨氯地平片——N-亚硝基氨氯地平杂质研究

FDA指南发布后，多家药企收到FDA或CDE的发补通知，其中涉及苯磺酸氨氯地平片中N-亚硝基氨氯地平杂质的研究。氨氯地平结构中含仲胺，存在形成NDSRI的风险。

案例四：酰胺类结构形成亚硝胺杂质的评估

CDE针对酰胺类化合物发补要求进行亚硝胺杂质评估。酰胺类化合物主要通过重排反应形成亚硝胺。评估需通过三种标准化的亚硝化条件进行强制降解实验。

六、亚硝胺杂质的风险评估与控制策略

6.1 风险评估的基本思路

亚硝胺杂质的风险评估应结合原料药的合成工艺、起始物料、溶剂试剂，同时避免使用受污染的原材料或回收材料。对于沙坦类、二甲双胍等药物应提供全面的风险评估报告。对于目前未检出亚硝胺杂质的药物，也可结合亚硝胺杂质的产生机理开展风险评估。

6.2 源头阻断策略

在原料药合成工艺开发期间，应结合生产工艺和溶剂试剂分析出现亚硝胺杂质的潜在可能，从源头阻断产生亚硝胺类杂质。具体措施包括：

• 优化合成路线，避免使用易于形成亚硝胺的原料和试剂

• 严格控制溶剂质量，避免使用可能降解产生胺类的溶剂（如DMF、DMAc）

• 在合成过程中添加亚硝化捕获剂（如抗坏血酸、亚硫酸盐等）

• 控制pH值、温度等反应条件

6.3 制剂阶段控制

• 严格辅料质控：建立辅料供应商质量体系，严格筛选和检测辅料中的亚硝酸盐含量

• 环境控制：改善生产环境的空气质量，减少氮氧化物的污染

• 包装材料选择：使用经过亚硝胺风险评估的包装材料

• 储存条件优化：控制储存温度和湿度

6.4 分析方法要求

亚硝胺杂质的检测需要使用高灵敏度的方法。对于每日最大给药剂量高于1克的药品以及采用一种方法检测多个亚硝胺杂质时，均应建立定量限更低的分析方法（原料药和制剂分析方法的LOQ≤0.03 ppm）。

七、结语

亚硝胺杂质的生成贯穿原料药合成和制剂生产的全过程，其根本原因在于胺类前体与亚硝化试剂在适宜条件下的相遇。原料药合成阶段的主要风险来自胺类中间体的直接亚硝化、溶剂的降解产物参与反应以及污染引入；制剂阶段的主要风险来自辅料中的亚硝酸盐、药物自身的降解以及包装材料的贡献。

从CDE的发补实践来看，审评要求已从仅关注NDMA、NMBA等少数小分子亚硝胺，扩展到对与药物结构相关的NDSRIs进行全面评估。含仲胺、叔胺结构的API均需进行NDSRI风险评估，制剂中辅料和包材的贡献也不容忽视。

建议企业在药品研发早期即开展亚硝胺杂质的系统性风险评估，结合具体的合成工艺和制剂处方，识别所有潜在的亚硝胺生成途径，建立从源头到终产品的全链条控制策略，以避免因亚硝胺杂质研究不充分而导致的审评发补。